5-乙炔基尿苷：一種具有生物正交標記潛力的mRNA治療用核苷類似物
2026年03月12日 01:20一、EU修飾mRNA的表達特性與機制分析
為評估EU修飾對mRNA功能的影響，研究合成了全部尿苷被EU、Ψ、m1Ψ或未修飾尿苷（U）取代的編碼黃色熒光蛋白（YFP）的mRNA。在人源巨噬細胞中通過電穿孔轉(zhuǎn)染后，流式細胞術(shù)檢測顯示，EU修飾mRNA的YFP蛋白表達水平顯著低于其他組別（m1Ψ > U > Ψ > EU）。然而，該表達水平在觀測時間內(nèi)保持穩(wěn)定，表明EU修飾并未導致蛋白產(chǎn)物的快速衰減。
進一步的機制探究揭示了表達差異的多因素成因。首先，定量PCR分析顯示，細胞內(nèi)EU修飾mRNA的豐度約為其他修飾形式的十分之一，提示其轉(zhuǎn)染或細胞內(nèi)穩(wěn)定性可能存在差異。其次，無細胞體外翻譯體系實驗結(jié)果排除了細胞特異性因素的干擾，證實EU修飾mRNA本身的翻譯效率確實最低（約為未修飾mRNA的1/10）。綜合表明，EU修飾mRNA較低的蛋白產(chǎn)量是其轉(zhuǎn)染/穩(wěn)定性與固有翻譯效率共同作用的結(jié)果。
二、EU修飾mRNA的低免疫原性特征
評估核苷類似物的免疫激活潛能至關(guān)重要。研究通過檢測關(guān)鍵炎癥因子與干擾素刺激基因的表達來評估先天免疫響應。酶聯(lián)免疫吸附測定顯示，轉(zhuǎn)染24小時后，所有修飾mRNA（EU, Ψ, m1Ψ）誘導產(chǎn)生的白細胞介素-6（IL-6）水平均處于低位，其中EU修飾組與未修飾U組存在統(tǒng)計學顯著差異，表明其有效的免疫沉默能力。
對干擾素通路下游基因MX1，以及免疫相關(guān)基因PKR與TAP2的轉(zhuǎn)錄水平分析進一步證實了這一點。未修飾及Ψ修飾mRNA能一定程度誘導MX1表達上調(diào)，而EU與m1Ψ修飾mRNA則未引起明顯變化。對于PKR與TAP2，EU與m1Ψ修飾同樣未顯示激活效應，甚至略有抑制。這些數(shù)據(jù)一致表明，EU修飾與m1Ψ相似，能有效規(guī)避由mRNA觸發(fā)的固有免疫識別通路。
三、EU修飾對mRNA二級結(jié)構(gòu)的影響
為探究觀察到的表型是否源于mRNA折疊的改變，研究采用SHAPE-MaP技術(shù)分析了不同修飾mRNA的二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，Ψ與m1Ψ修飾的mRNA結(jié)構(gòu)高度相似，且與未修飾U的mRNA存在顯著差異。相比之下，EU修飾mRNA的全局折疊與未修飾U的mRNA最為接近。深入分析顯示，Ψ與m1Ψ可能通過增強堿基配對的穩(wěn)定性來影響結(jié)構(gòu)，而EU對堿基配對的影響相對較弱，其反應性譜與天然尿苷存在差異但不同于Ψ/m1Ψ。這說明，EU、Ψ和m1Ψ雖然都改變了局部化學環(huán)境，但引起了不同的結(jié)構(gòu)后果，且EU的表型在很大程度上獨立于對天然mRNA整體折疊的重塑。
四、結(jié)論與展望
本研究系統(tǒng)表征了5-乙炔基尿苷（EU）作為mRNA中尿苷替代物的特性。核心發(fā)現(xiàn)包括：
1. 低免疫原性：EU修飾能有效避免巨噬細胞的先天免疫激活，效果與目前廣泛應用的m1Ψ相當。
2. 獨特的表達與折疊特性：EU修飾導致mRNA的轉(zhuǎn)染/穩(wěn)定性和翻譯效率降低，但其蛋白表達穩(wěn)定。其修飾的mRNA二級結(jié)構(gòu)更接近天然形態(tài)，這與Ψ/m1Ψ明顯不同。
3. 生物正交標記潛力：EU攜帶的炔基為其關(guān)鍵優(yōu)勢，可通過點擊化學反應實現(xiàn)mRNA的特異性標記與追蹤，這在成像、定位或親和純化等應用中具有重要價值。
綜上所述，5-乙炔基尿苷不僅是一種有效的免疫沉默修飾，其獨特的化學與結(jié)構(gòu)特性，特別是為生物正交標記提供的化學手柄，使其在基礎(chǔ)研究及下一代mRNA治療與疫苗的精細化開發(fā)中具有廣闊的應用前景。
五、提供labeling EU的廠商有哪些？
南京優(yōu)愛蛋白自主研發(fā)的 Protein labeling EU（5-乙炔基尿苷）（貨號：UA086024），是一款基于5-乙炔基尿苷（EU）點擊化學標記技術(shù)開發(fā)的高效、特異性蛋白標記工具。本產(chǎn)品利用EU作為尿苷類似物，可在RNA合成過程中摻入新生RNA鏈，再通過點擊化學反應與熒光染料或生物素等報告分子高效偶聯(lián)，實現(xiàn)RNA的標記與可視化，適用于RNA轉(zhuǎn)錄與代謝追蹤、細胞增殖檢測、成像分析及高通量篩選等領(lǐng)域。
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